肝癌包括原发性和转移性癌症。肝细胞癌（HCC）约占原发性肝癌的85％，代表了全世界与癌症相关的死亡的第二大最常见原因[1,2]。肝癌的主要危险因素是慢性HBV和HCV感染，它们在肝脏中引起慢性炎症[3,4]。由于肝癌通常在晚期被诊断出来，因此很少有患者接受手术治疗，并且在5年内复发使70％的病例复杂化[5]。大多数HCC患者接受局部或全身治疗，例如化学疗法，放射治疗，经皮乙醇注射，射频消融，各种栓塞程序和索拉非尼。然而，这些疗法的疗效不足[6]。
肝转移瘤比原发性肝癌更为常见，因为结肠癌，直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，肺癌和其他器官癌通常转移到肝脏[9]。尽管生存率各不相同，但对于未经治疗的肝病患者来说却很少转移要生存5年以上。手术切除是唯一的治疗方法。但是，很少有患者有资格使用这种治疗方法[9,10]。因此，迫切需要一种新颖有效的肝癌治疗方法。
在这篇综述中，我们主要探讨肝癌的免疫特性，CAR-T疗法在肝癌治疗中的应用所面临的障碍以及CAR-T疗法的近期临床前和临床试验。
典型的CAR由三个元素组成，即具有或不具有铰链/间隔子的细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域（图1）[34,35]。
大多数CAR将由与肿瘤相关的抗原特异性单克隆抗体的可变重链和轻链构成的单链可变片段作为细胞外抗原识别域。也可以使用配体或受体，例如CD27受体和血管内皮生长因子[36,37]。单链可变片段和跨膜结构域之间的CAR铰链/间隔区通常包括CD4或CD8的CH2CH3或Ig样细胞外部分[38]。铰链/间隔子很重要，因为它确保了对CAR-T细胞表位的可及性并稳定了CAR的表达[36]。细胞内信号传导域具有两个部分，即共刺激信号和激活信号。根据共刺激分子的数量，CAR蛋白可以分为三代。
CAR-T产生的基本过程（图1）如下：（i）从患者外周血中切出，收集外周血单核细胞；（ii）使用免疫选择性珠子从外周血单核细胞中分离T细胞，并使用抗CD3和IL-2进行激活；（iii）CAR-T的基因修饰；（iv）体外T细胞的扩增；（v）评估以确保CAR表达和T细胞的一般状况；（vi）将CAR-T输回患者体内。
在这些步骤中，应注意三个关键点。首先，许多研究表明，与典型方法相比，未分化T细胞的过继转移，例如幼稚和中央记忆T细胞亚群，可导致更好的持久性和抗肿瘤作用。已经报道了分化程度较低的T细胞的分离和适用于分化程度较低的T细胞的培养条件的应用[45,47]。其次，有效的基因修饰方法必不可少。另外，还应考虑CAR-T的输注途径。与全身静脉注射相比，局部注射，尤其是肿瘤内注射，可能具有更好的治疗效果，且*性更低，这在临床实践中很常见[53,54]。
改善CAR-T治疗在肝癌中的疗效和安全性的策略在血液系统恶性肿瘤的治疗中已显示出令人鼓舞的结果[55,56]。因此，已经进行了许多试验以评估CAR-T疗法在实体瘤中的功效。然而，临床结果并不令人满意，表明缺乏治疗反应和/或一些严重的副作用。阻碍治愈性治疗的障碍包括缺乏特异性肿瘤抗原，有限的CAR-T细胞运输和向肿瘤部位的渗透以及免疫抑制性肿瘤微环境。特定的肿瘤抗原将在本综述的后面进行描述。
尽管CAR-T具有令人鼓舞的治疗效果，但仍具有一些实质性的副作用[74]。根据靶标与肿瘤之间的关系，副作用可分为三种类型：靶标/肿瘤上的*性（肿瘤溶解综合征和细胞因子释放综合征），靶标/肿瘤上的*性和靶标/肿瘤外*性。为了控制这些副作用，已经开发了几种策略，包括增强CAR的选择性和控制CAR-T活性[75]。
最直接的策略是选择一种更安全的抗原以增强选择性（图2Ci）。迄今为止，表皮生长因子受体（EGFR）vIII是唯一严格限于肿瘤细胞的肿瘤特异性抗原[76]，并且一些临床试验（NCT，NCT）正在评估神经系统肿瘤中的该靶标。Mucin-1（MUC-1）由于其异常的糖基化作用和极性在许多肿瘤中的丧失而可能是一种有效的替代靶标[77,78]。中国的研究人员目前正在尝试使用MUC-1CAR-T疗法来治疗HCC（NCT）。由于高度特异性的抗原很少，因此，开发了一种使用组合抗原而不是一个抗原靶标的更实用的策略（图2Cii-v）。
Duong及其同事产生了协同的双重特异性CAR-T，仅在存在两种抗原的情况下才具有完全的抗肿瘤作用，而在受一种抗原刺激时则活性较低[79]（图2Cii）。互补的双特异性CAR-T允许细胞内结构域的两个部分分别连接至两个不同的CAR，以实现相似的抗癌作用[80]（图2Ciii）。
此外，已经开发了一种涉及合成Notch（synNotch）受体的新方法，其包括抗原识别结构域，Notch核心和转录因子。synNotch受体识别出第一种抗原后，转录因子被释放以诱导第二种抗原的CAR表达。这样，synNotchCAR-T可以选择性清除表达两种抗原的肿瘤细胞，而不会破坏仅表达两种抗原之一的细胞[81,82]（图2Civ）。
除了这些方法外，还可以将对正常细胞上的抗原具有特异性的抑制性CAR添加到CAR-T中，从而通过阴性抑制性CAR信号传导保护正常细胞免受CAR-T介导的攻击[83]（图2Cv）。
由于副作用是不可避免的，因此必须以某种方式控制CAR-T活性。这可以通过选择性消融改造成表达自杀基因的CAR-T细胞中的CAR-T来实现[84,85]（图2Di）。通过电穿孔体外转录的mRNA进行CARs的瞬时表达也可以克服这个问题，因为可以根据需要将T细胞注入患者体内[86]（图2Dii）。而且，新设计的可切换CAR-T细胞的活性可以由外源分子控制，该外源分子可以充当桥以连接CAR结构的两个相邻结构域，例如铰链或细胞内结构域。这些CAR-T细胞只有在这些分子存在的情况下才能消除肿瘤细胞[87,88]（图2Diii，iv）。
肝癌的临床前和临床试验CAR-T疗法已在肝癌中进行了临床前和临床测试。由于肿瘤相关抗原的选择直接反映了CAR-T细胞的功效和安全性，因此我们将基于抗原分别描述临床前和临床研究（表1）。
Glypican-3（GPC-3）
GPC-3是一种70-kDa的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，它通过糖基磷脂酰肌醇锚固物附着在细胞膜上[89]。GPC-3通常在人类胚胎和某些成年组织（卵巢，乳腺，间皮，肺和肾脏）中表达，但在健康的成年肝脏中无法检测到[89,90]。然而，已在肝癌中检测到GPC-3过表达，并与诊断和不良预后有关[91,92]。
最早的GPC-3CAR-T细胞是由Gao等人构建的[93]。在他们的研究中，测试了1G和3G（CD28和4-1BB）CAR-T细胞。他们证明，GPC-3CAR-T细胞可以在体外消除GPC-3阳性HCC细胞，而3GCAR-T细胞可以在体内抑制已建立的原位异种移植物的生长。另一组通过评估表达编码带有或不带有内域的CD28和4-1BB的GPC-3-CAR的T细胞的抗肿瘤特性，比较了CD28和4-1BB的贡献[94]。在体外，通过CD28信号转导的T细胞具有比通过4-1BB信号转导的T细胞更高的细胞*性。然而，4-1BB在体外和体内都诱导了CAR-T细胞的优异扩增。
江等[95]在患者来源的异种移植物中发现了相似的结果。发现以CD28和4-1BB为特征的GPC-3和去唾液酸糖蛋白受体1靶向的双靶CAR-T细胞共表达可降低体内和体外靶点/肿瘤外*性的风险[96]。基于这些发现，已经进行了一些临床试验以评估GPC-3CAR-T细胞的安全性和有效性。医院的研究人员正在尝试将CAR-T治疗与经导管动脉化疗栓塞（NCT）结合起来，其他一些研究者已经使用肿瘤内注射来增强CAR-T治疗的疗效（NCT，NCT）。
综上所述，这些发现表明，GPC-3可能是治疗HCC的流行靶标。
MUC-1
MUC-1是一种跨膜糖蛋白，通常在乳腺，食道，胃，十二指肠，胰腺，子宫，前列腺和肺的腺或腔上皮细胞中表达[97,98]。由于转化和极性丧失，糖基化的MUC-1异常在许多肿瘤组织中过度表达，例如乳腺癌，胃癌，结肠癌和肝癌。因此，MUC-1可用作癌症的生物标志物和治疗靶标。在HCC细胞（QGY-）中测试了靶向HCC上糖基化MUC-1的1G和3GCAR-T细胞[99]。研究结果表明，MUC-1CAR-T治疗可以特异性杀死MUC-1过表达的HCC细胞。MUC-1CAR-T细胞的临床试验目前正在进行中（NCT）。
上皮细胞粘附分子（EpCAM）
EpCAM是另一种跨膜糖蛋白，参与细胞信号传导，迁移，增殖和分化[]。被鉴定为肝干/祖细胞的标志物，EpCAM还被发现在肝癌中被上调，并且与低分化的肝癌和不良的预后有关[]。因此，EpCAM可能是潜在的治疗靶标。在一些实体瘤中，例如前列腺癌，乳腺癌和腹膜癌中，已经对EpCAMCAR-T细胞进行了临床前测试[-]。但是，尚无临床前研究检查过肝癌中的EpCAMCAR-T细胞。
目前有两个医疗中心在临床环境中测试EpCAMCAR-T细胞（NCT，NCT）甲胎蛋白（AFP）AFP是一种糖蛋白，通常在HCC中过表达，并且是潜在的治疗靶标。但是，AFP在细胞内表达和分泌，因此被认为不适用于CAR。
为了克服这个问题，刘等人[]设计了针对AFP-MHC复合物的高度特异性抗体，并将该抗体工程化为可表达为CAR。他们发现，这些“T细胞受体样”CAR-T细胞在体内肝癌异种移植模型中引起肿瘤生长的显着抑制。“T细胞受体样”CAR-T为抗原选择提供了更多选择，并且在肝癌治疗中可能具有更多潜在应用。
病*抗原
病*感染，特别是被HBV和HCV感染，是HCC的主要危险因素之一。HBV和HCV都是已知的癌病*。因此，作为病因学治疗，靶向病*抗原对于肝癌的治疗可能是有效的。
Bohne等[]首先设计了针对HBV-S和HBV-L蛋白的2GCAR，它使T细胞能够识别HBsAg阳性的HepG2细胞，释放干扰素-γ和IL-2，并裂解HBV复制细胞。特别是，HBV-SCAR-T细胞比HBV-LCAR-T细胞更有效，可溶性HBV不会阻断CAR-T的功能。
克雷布斯（Krebs）等[]在具有免疫功能的HBV转基因小鼠中测试了HBV-SCAR-T细胞，结果表明CAR-T细胞位于小鼠肝脏中以阻断HBV复制，仅引起短暂性肝损伤。或者，构建了一种特异性针对HCVE2糖蛋白的2GCAR，以测试该CAR控制HCV感染的能力[]。HCVE2CAR-T细胞能够分泌抗病*和促炎细胞因子，并裂解被HCV感染的肝癌细胞。不幸的是，研究人员并未在体内和临床上测试这些CAR-T细胞的抗肿瘤作用。
在任何情况下，特异于病*抗原的CAR-T细胞都可能具有良好的治疗效果，尽管仍需进一步研究。
癌胚抗原（CEA）
作为糖基磷脂酰肌醇固定的kDa糖蛋白，CEA在许多细胞表面广泛表达包括结肠，胃，胰腺，卵巢和肺的肿瘤[]。CEA在正常成人组织中的表达仅限于面对肺和胃肠道内腔的上皮细胞膜的顶表面，使其对免疫细胞不可见[]。
CEACAR-T细胞的首次临床试验在英国进行（NCT）。研究人员使用1GCAR-T细胞治疗CEACAM5阳性癌症，并在由于急性呼吸道*性而过早关闭之前收集了14例患者[]。其中十名患者有肝转移。然而，值得注意的是，1GCAR-T细胞的临床疗效受到持久性差和依赖预处理的短暂呼吸*性的限制。
随后，罗杰·威廉姆斯医学中心进行了一项试验，以测试2GCAR-T肝动脉输注治疗无法切除的CEA阳性肝转移的安全性和潜在疗效（NCT）。该试验揭示了CEACAR-T肝动脉输注在具有大量肿瘤负担的大量预处理人群中的安全性，并具有令人鼓舞的临床活性，并表明中性粒细胞/淋巴细胞比率增加与CAR-T肝动脉输注后不良反应相关[,]。基于这些结果，目前正在进行两项后续的Ib期试验（NCT，NCT）。
此外，由于肝脏具有独特的免疫生物学特性，同一位研究人员在小鼠CEA阳性肝转移模型中研究了CEACAR-T细胞，并确定了肝髓样抑制细胞扩展和抑制CAR-T功能的机制[]。他们的发现表明，将CEACAR-T细胞与靶向肝髓样抑制细胞的药物相结合可能是未来临床试验的合理策略。
医院目前正在尝试静脉内注射CEACAR-T细胞，以治疗CEA阳性癌症的肝转移（NCT）。最近，他们招募了10名大肠癌患者，并证明即使在高剂量下，CEACAR-T治疗对这些患者也具有良好的耐受性。另外，在大多数接受治疗的患者中观察到一些疗效[]。
其他目标
最近的一项研究报道了两项针对TAG-72的1GCAR-T细胞的1期临床试验。这些是CAR-T细胞在实体瘤治疗中的首次人类试验[]。在第二项试验中，通过肝动脉输注对9例结直肠肝转移患者进行了CAR-T细胞治疗。结果揭示了TAG-72CAR-T细胞的相对安全性和1GCAR-T细胞的有限持久性，间接支持了在CAR设计中掺入共刺激结构域以及使用完整的人CAR构建物来减轻免疫原性。
在肝癌中经常观察到EGFR家族蛋白的异常表达。Morgan等[74]报道了在施用针对ERBB2的2GCAR-T细胞治疗大肠肝转移后发生严重不良事件的案例。通过识别肺上皮细胞中低水平的ERBB2，大量施用的细胞触发了细胞因子的释放，并导致了急性呼吸窘迫综合征。此外，医院的研究人员报告了另一例，其中一名患者在EGFRCAR-T治疗（NCT）之后进展的胆管癌患者获得了另一部分切换为具有严重但可控的表皮/内皮*性的CD特异性CAR-T免疫疗法（NCT）后的反应[]。这两项试验仍在进行中。
在这篇综述中，我们总结了针对原发性和转移性肝癌的CAR-T治疗的当前临床前和临床试验，尤其是针对GPC-3，MUC-1和CEA的治疗。迄今为止，尚未完成HCC的临床试验。然而，体外和体内的临床前研究显示了有效的抗肿瘤功效。尽管已证实CAR-T在肝转移中的安全性，但仍观察到一些严重的副作用。此外，与血液恶性肿瘤中的CAR-T不同，CAR-T在肝癌中的成功应用仍必须克服几个障碍。因此，基于肝脏的特异性免疫生物学，应进一步研究一些特定策略，包括局部注射（肝动脉输注和肿瘤内输注）以及靶向肝髓样抑制细胞的药物。
本篇综述集中在肝脏原发性和转移性肿瘤的CAR-T治疗上。CAR-T治疗肝癌的研究仍处于初步阶段，CAR-T临床应用的安全性和有效性尚不清楚。此外，还应探索使用其他方法的联合治疗方法。尽管如此，我们对CAR-T治疗将在不久的将来为肝癌治疗提供新的方法感到乐观。
~本文DOI:10.6/j.hbpd..05.
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