杨鑫，贾户亮，钦伦秀.肝癌术后复发的分子机制及其预测研究进展[J].中国实用外科杂志,,39(10):-.
肝癌术后复发的分子机制及其
预测研究进展
杨鑫，贾户亮，钦伦秀
中国实用外科杂志,,39(10):-
摘要根治性切除是原发性肝癌的最重要治疗方式，但复发率高是影响病人术后生存的主要原因。根据复发时间，肝癌术后复发分为早期复发和晚期复发，前者主要与肿瘤侵袭转移有关，后者主要由于肝病背景基础上的多中心发生所致。早期预测术后复发风险有助于及时有效干预、改善预后。近十余年，临床上围绕肝癌术后复发进行了系统研究，对转移复发的分子机制有了新认识：肝癌转移潜能始于原发瘤早期；微环境炎性反应失衡促进癌症发生转移。同时，识别和鉴定出多种预测复发的分子标记物，创建并优化了肝癌转移分子预测模型。这些研究成果为临床更准确地把握肝癌复发转移规律，制订更加精准预防和治疗策略奠定基础。
基金项目：国家自然科学基金面上项目（No.）
作者单位：医院普外科复旦大学肿瘤转移研究所，上海
通信作者：钦伦秀，E-mail：qinlx
fudan.edu.cn我国是肝癌（hepatocellularcarcinoma）高发地区，每年新发病例数及死亡人数均占全球的50%以上［1］。目前，手术切除是肝癌最主要治疗手段，但术后5年复发率60%，成为进一步延长病人生存的主要影响因素［2］。研究术后复发的分子机制、早期预测复发风险，有助于寻找有效的干预措施，改善预后。根据复发时间，肝癌术后复发可分为早期复发（术后2年内）和晚期复发（2年后）［3-4］。二者的原因和危险因素有所不同，一般认为早期复发主要来源于原发肿瘤的肝内播散，与癌细胞的侵袭转移有关；而晚期复发主要来自肝脏新发肿瘤，与慢性肝病背景下肿瘤发生有关［5］。影响肝癌术后复发的因素很多，包括肿瘤的临床病理学特征、伴发的肝病背景、癌细胞的分子生物学及代谢特征、以及微环境和宿主炎症免疫反应状态等。近年来，随着分子细胞生物学、遗传与表观遗传学、特别是组学技术的进步与发展，笔者团队围绕肝癌术后复发进行了系统研究，对转移复发的分子机制有了新认识，并识别和鉴定多种预测复发的分子标记物。本文对相关主要进展进行阐述。1对肿瘤转移机制的新认识为术后转移复发的预测提供理论基础转移播散是肝癌转移复发（特别是早期复发）的主要原因。癌转移是“种子”（癌细胞）与“土壤”（宿主微环境）相互作用的多步骤复杂过程，尽管对这一复杂过程探究已余年，在转移理论、转移模型和相关分子研究方面有很多进展，但肿瘤转移的机制尚不清楚，传统经典转移理论难以解释许多临床现象，更缺少有效预测与干预手段。为此，笔者团队从全基因组层面系统研究肝癌转移机制，有如下一些新的发现。1.1肝癌转移潜能始于原发瘤早期目前，关于肿瘤进展过程中癌细胞获得转移能力的时间仍有争论。经典理论认为转移潜能是癌进展过程中癌细胞克隆筛选的结果，发生在晚期，但难以解释临床上原发瘤很小（甚至未发现明显原发瘤）即已发生远处转移，以及肿瘤体积相似但术后预后明显不同等现象。年，笔者团队与美国同道合作通过全基因组水平研究发现，有无转移的肝癌原发瘤具有完全不同的基因表达谱，而大肝癌与小肝癌、原发瘤与转移灶间基因表达谱非常相似。提示促使肝癌转移的基因改变在原发瘤即已存在，小肝癌也可高转移。首次提出“促肝癌转移基因改变始于原发瘤”的观点［6］。年，Hu等［7］进一步证实了此发现，其首次用基因组测序大数据发现原发瘤和转移灶间的基因组差异非常小，癌细胞很早即获得了促转移的驱动基因改变。80%的转移性肠癌在原发瘤临床无法检出时（0.01?cm3）已发生远处转移［7］。这些发现补充、完善了经典转移理论，为通过分析原发瘤分子特征，早期预测术后转移复发风险提供了理论依据。
1.2微环境炎性反应失衡促转移以往多重视对“种子”的研究，轻视“土壤”的重要作用。肿瘤微环境是一个动态系统，由肿瘤细胞、间质组织、细胞外基质、组织低氧及饮食、胃肠道微生物群落和微泡等组成。肝脏微环境在肝细胞癌发生和发展中起重要作用。肝癌微环境主要组成成分包括肝癌细胞及肿瘤干细胞、促肿瘤炎性细胞（如星形细胞、Kufpper细胞、树突状细胞、Treg细胞）、肿瘤相关成纤维细胞、细胞外基质及各类细胞因子等。微环境中细胞和非细胞成分相互协同，形成“壁龛”（niche），具有局部免疫抑制、炎性反应异常、弥漫性血管与淋巴管新生、器官亲嗜性，以及代谢-微环境-表观遗传重编程等特征，为播散癌细胞的种植与生长创造有利条件［8-9］。笔者团队前期与美国合作研究发现伴有与不伴转移肝癌的癌周肝组织（非癌组织）基因表达谱差异明显，伴转移的癌周肝组织存在明显的促炎Th1-like细胞因子［如肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素γ（IFNG）、白细胞介素1（IL1）］显著下调，而抗炎Th2-like细胞因子（如IL4、IL5、IL8、IL10)显著上调，提示微环境炎症免疫状态失衡（Th1/Th2偏移）在促进肝癌转移中发挥重要作用，并且证明其中巨噬细胞集落刺激因子-1（CSF-1）是诱发Th1/Th2偏移的根源，炎症免疫标签也可预测肝癌转移复发和预后［10］。
上述对肝癌转移机制新认识的意义在于：（1）有助于修正对癌转移的传统认识，是对经典克隆筛选理论的完善，为转移的早期预测和防治提供理论基础。（2）有助于调整癌转移防治战略，早期从源头抓起，从整体入手。
2术后转移复发的新型分子标记物深入研究癌转移机制、识别关键调控分子是癌转移防治的基础。笔者团队从全基因组层面和代谢角度系统研究，揭示癌转移新机制，发现一组转移复发的标记物。2.1骨桥蛋白（OPN）基于基因表达谱筛选出OPN为最重要的促肝癌转移基因之一，为此围绕OPN进行十余年的系列研究［6,11］。功能研究证实其为潜在抗肝癌转移治疗靶点［12］。同时发现凝血酶与OPN协同作用，是OPN阳性肝癌转移干预靶点［13］。血清OPN水平可预测术后转移复发和病人生存［14-16］；术后血清OPN动态变化可监控术后复发［17］。进一步研究发现，肝癌病人OPN启动子4个SNP位点和14种单体型中，-T/T和Ht2对OPN表达和促转移具有重要调控作用［18］。OPN通过调节肝癌细胞DNA甲基化重组可增加CD+/CD44+癌干细胞的干性［19］；上调趋化因子受体（CCR）尤其是CCR1的表达，促进肝癌转移。CCR1可作为OPN阳性肝癌转移的干预靶点［20］。
2.2转移相关miRNAmiRNA是一类长17~25nt的单链非编码内源性RNA，是细胞在正常和病理状态下调控的关键分子。许多研究证实miRNA参与了肝癌的发生和发展，并通过靶向调控大量的关键蛋白质编码基因［IL-6、肝细胞生长因子（HGF）、cMet等］直接影响肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等［21］。笔者团队与美国同道合作采用miRNA芯片技术比较伴或不伴肝内微血管侵犯（转移）肝癌病人根治性手术切除组织的miRNA表达谱差异，筛选出一组与肝癌转移复发密切相关的miRNAs，对术后转移复发的早期预测与干预治疗具有潜在的临床应用价值［22］。进一步发现miR--5p通过调控E-钙黏蛋白（CDH1）促进肝癌的生长和转移，可预测病人预后［23］。miR-26a既通过调控IL-6-Stat3通路直接抑制肝癌细胞生长和转移，还通过调控HGF/c-met通路，抑制肿瘤血管生成，可作为肝癌复发的预测指标［24-25］。其他研究团队也证实多种microRNA在HCC侵袭转移中的重要作用，包括miR-34a可通过调控c-Met信号转导通路抑制肝癌细胞的侵袭和转移［26］；而位于染色体8q24.3区域的miR-扩增、miR-缺失可促进肝癌侵袭和转移［27-28］。
2.3血管生长因子血管生成是肿瘤生长和转移的必备条件，阻断血管生成已成为肿瘤治疗、特别是抗转移的一项重要途径。研究发现，血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（b-FGF）等许多血管生长因子是肝癌术后转移复发和无瘤生存的独立预后指标。笔者团队首次发现一种新的促肝癌血管生长因子PROX1，并通过同位素标记技术（SILAC）和表观遗传学等手段发现PROX1通过募集泛素特异性蛋白酶7（ubiquitinspecificprotease7，USP7）促进NF-κB/p65蛋白的稳定性，继而通过表观遗传学修饰选择性地激活IL-8的表达。而IL-8单抗可显著抑制PROX1阳性肝癌进展。这为抗肝癌转移复发治疗提供了新途径，并为肝癌转移复发精准防治提供精准分型方案［29］。
2.4高尔基体相关蛋白（GOLM1）在肿瘤进展过程中，细胞表面受体通过接受外界生长因子刺激，激活下游信号通路，进而促进肿瘤转移。其中表皮生长因子类受体（EGFR）的异常活化促进肿瘤进展和转移的关键因素之一。正常细胞中，EGFR与其配体结合在触发下游信号的同时被细胞膜内吞、包裹最终转运至溶酶体中降解，形成正常的负反馈调节机制，避免细胞增殖信号的持续活化。笔者团队通过基因表达谱研究发现，GOLM1是肝癌转移相关的关键基因之一；GOLM1高表达者术后早期转移复发风险高、预后不良。功能研究证实，GOLM1在肝癌生长和转移中发挥重要作用。首次发现其通过调控EGFR/受体酪氨酸激酶（RTK）在细胞内的循环再分布，导致下游激酶信号的持续激活，破坏EGFR反馈调节机制，驱动肝癌转移。这将有助于更加精准地预测及个体化干预肿瘤的转移与复发。GOLM1有可能成为肝癌转移的潜在标记和治疗靶点［30］。这一结果发表时，CancerCell杂志配发述评，认为此发现“开创了RTK内吞与癌侵袭转移的全新研究领域”［31］。
2.5代谢物代谢重编程是癌细胞的重要特征之一，但如何驱动癌转移知之甚少。越来越多的研究显示，代谢重编程不仅影响肿瘤生长，而且在从肿瘤细胞脱离原发灶、形成循环肿瘤细胞（CTC）、到重塑转移靶器官微环境以利于CTC定植生长等进程中均发挥了重要作用［32］。近年研究发现，糖代谢、氨基酸和脂质与胆固醇代谢重编程影响癌细胞的侵袭转移能力，并重塑微环境、影响T细胞杀伤功能、介导癌细胞-微环境相互作用、影响间质细胞的代谢变化等，参与调控癌进展和转移。笔者团队近期研究发现，代谢酶酰基辅酶A硫脂酶12（ACOT12）是调控肝癌细胞乙酰辅酶A代谢的关键酶，其下调与肝癌转移及预后密切相关，通过上调乙酰辅酶A水平和组蛋白乙酰化水平，进而通过表观激活TWIST2［肿瘤上皮间质转化（EMT）的重要转录因子］的表达，促进肝癌细胞EMT和转移。从代谢角度认识癌转移提供了新的思路［33］。近年来，有多篇研究报道了在不同类型的肿瘤（包括乳腺癌，脑胶质瘤和前列腺癌）中乙酰辅酶A可促进肿瘤侵袭转移的表型［34-37］。
3创建更精准的肝癌转移复发预测模型如何及早预测肝癌转移复发风险是临床难题。笔者团队基于转移和关键分子的创新性研究证实分子预测转移可行，并提供预测新手段，创建了以下两种转移复发预测新方法。3.1基于个转移相关基因，首次建立肝癌转移分子预测模型如前所述，伴转移与不伴转移肝癌之间基因表达差异明显（个差异表达基因），基于此，笔者团队建立了能正确预测肝癌转移的多分子预测模型，小样本研究发现区分肝癌有无转移的准确率达90%［6］。两组独立大样本证实其可准确预测肝癌预后，为全球第二个经大样本验证的转移预测模型（第一为乳腺癌）［38］。进一步优化为“五基因预测模型”，大样本前瞻性研究证实其准确率70%。已合作进行试剂盒开发。
3.2基于17个炎症免疫因子建立转移预测模型，证实炎症免疫反应也可预测转移小样本证实其预测肝癌转移复发和病人生存准确率达92％［10］。进一步优化出“五基因预测模型”，其准确率70%。同时，在蛋白水平证实癌旁肝组织中IL-2和IL-15表达水平是独立的预后因素，可用于预测早期肝癌病人根治性切除术后的生存与预后［39］。
4液体活检技术为研究肝癌转移机制、预测复发风险提供新的手段液体活检（liquidbiopsy）是指通过捕获体液（包括外周血、尿液或其他液体）的细胞、分子标记物或遗传物质异常，替代组织活检，达到准确诊断、判断预后和监控疗效的作用［40］。除了检测血清甲胎蛋白（AFP）水平外，最早用于肝癌的液体活检是检测病人外周血AFPmRNA水平，被认为肝癌细胞播散进入血循环的分子标记物，并且可以预测肝癌病人术后早期肝内复发和远处转移［41］。近年来，液体活检技术发展迅速，包括CTC、循环肿瘤DNA（ctDNA）、ctRNA（miRNA和lncRNA）、血清代谢指标、外泌体RNA等，采用液体活检新型诊断标记物进一步改善肝癌的诊断和治疗，有助于预后评估和复发监测，促进肝癌个体化治疗模式的转变。CTC计数及其表型分析，特别是干细胞表型的CSC发现被证实与肝癌术后近期复发和预后密切相关［42］。ctDNA是由肿瘤细胞释放入血，约占整个循环游离DNA（cfDNA）的0.1%~1.0%。读取分析ctDNA携带的信息（突变、表观遗传修饰及完整性），用于筛查、判断预后和进展，寻找干预策略。笔者团队于年即已应用简单的聚合酶链式反应-杂合型缺失（PCR-LOH）分析技术研究证实在肝癌病人外周血DNA中检测染色体8p缺失可预测肝癌转移复发和病人预后［43］。近年来，由于富集技术和测序技术的快速进步，推动了CTC和ctDNA检测的临床应用［44］。
总之，肝癌转移是一个复杂过程，经过近年的努力，对肝癌转移有了新的认知，发现肝癌转移潜能始于原发瘤早期，修正了“转移发生在癌进展晚期”的传统认识；发现微环境炎性反应失衡促转移，修正了“重种子、轻土壤”的传统认识。同时发现OPN、PROX1、GOLM1、ACOT12、miR26a等多个肝癌转移复发关键基因或分子，创建并优化了两个肝癌转移分子预测模型，进行临床转化。这些研究成果，为临床更准确地把握肝癌复发转移规律，制订更加精准预防和治疗策略奠定基础。随着液体活检技术的快速进步，为研究肝癌转移机制、预测复发风险提供了新的手段。
（参考文献略）（-09-04收稿）版权声明
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