Single-celllandscapeoftheecosysteminearly-relapsehepatocellularcarcinoma(IF48.)
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，肝细胞癌（HCC）复发率高、5年生存率较低。研究复发患者的单细胞表达谱可能会对设计有效抗癌疗法，包括免疫治疗具有重要意义；年12月，医院樊嘉院士团队在CellPress细胞出版社旗下期刊Cell《细胞》上发表了一篇新研究：运用单细胞全长转录组测序技术+mIHC技术，对肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微环境做出了系统性的刻画，在单细胞水平上揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制。
技术亮点：单细胞测序技术+mIHC
实验设计：首先对12例原发和6例早期复发HCC患者的肿瘤组织和癌旁组织通过CD45+筛选出免疫细胞和非免疫细胞解离获得近个细胞，进行全长转录本测序，对数据进行细胞亚型鉴定和基因鉴定。在2个独立的队列（第1队列选择4例患者的配对原发肿瘤和复发肿瘤；第2队列，筛选47例患者的配对原发肿瘤和复发肿瘤）对相关结果进行了验证，并对得到的肿瘤微环境变化给出了合理的解释，为后续肝癌的治疗提供新思路。
分析结果展示：为了构建一个全面的肿瘤微环境图谱，作者对得到的单细胞测序结果进行细胞分类和基因鉴定，(t-SNE)展示了24个免疫细胞簇及单独对骨髓细胞进行聚类分群；并展示了不同样本种的比例，基因表达图谱显示M1和M2型巨噬细胞高表达CD和CD68,通过其他相关基因辅助计算说明M2型巨噬细胞表达占优势，CD细胞在单细胞测序结果及组化双染验证实验PT和RT间存在显著性差异，表明MHC-II抗原呈递在肿瘤中占主导地位。
为了进一步研究RT样本中CD8+T细胞的独特转录状态，作者测定了不同CD8亚型重要的基因表达；火山图展示PT和RT中CD8+T细胞表达的差异基因，IPA显示RT介导的CD8+T细胞OX40下调，T细胞信号通路衰竭，表明这些细胞处于低活化但不衰竭的状态。DEG分析还显示，RT中的CD8+T细胞上调了KLRB1(CD)和IL7R，这一点组化双染的结果也得到了证实，CD+CD8+T细胞在RT中的富集与更高的第二次复发率显著相关；RNA-seq验证高表达组患者临床预后明显较差；这可能会抑制传统效应CD8+T细胞和NK细胞对复发肿瘤的浸润；也有问题支持KLRB1highCD8T细胞标记作为HCC患者不良临床结局的重要指标。
部分分析显示PT中细胞周期相关通路富集有更高的增殖和更低的肝功能信号，而在RT中主要是免疫反应通路有更高的免疫监视和逃逸信号；这在验证队列1中得到了证实。在与免疫逃逸相关的基因中，观察到恶性细胞中CD47的表达增加，提示其可能抑制DC成熟和抗原呈递，以及对巨噬细胞靶向性的抵抗，并伴有新抗原释放的减少。同样，观察到RT中HLA/B/C表达水平升高，表明对nk介导的细胞死亡的耐药性增强。患者P07在RT样本中携带HLA-B错义突变，在相应的PT样本中没有发现，可能导致恶性细胞中新抗原肽呈现减少。数据表明RT具有低增殖率和高躲避免疫介导细胞死亡的能力。本研究通过多重免疫荧光染色证实，复发肿瘤中CD80+CD1C+DC存在于PD-L1+的恶性细胞附近，支持了2种细胞之间的相互作用。
本研究主要科学发现可以概括为以下四点：
1.首次揭示肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微生态系统存在显著差异。与肝癌原发肿瘤相比，早期复发肿瘤中浸润更多的树突状细胞（DC）和CD8+T细胞，而起免疫抑制作用的调节性T细胞浸润更少，提示早期复发肝癌的免疫逃逸机制有别于肝癌原发灶。
2.发现早期复发肝癌中的特征性T细胞亚群：CD+CD8+T细胞。早期复发肝癌中浸润的CD8+T细胞特异性表达CD分子，具有固有免疫样、低细胞毒、低克隆扩增和记忆性的表型。早期复发瘤内的CD+CD8+T细胞数增多与术后预后不良显著相关。早期复发肝癌大量浸润的CD+CD8+T细胞处于未激活状态，导致免疫监视失效，是肝癌术后早期复发的重要原因之一。进一步分析早期复发肝癌细胞和CD8+T细胞的克隆起源，我们发现早期复发肝癌细胞来源于原发肝癌的子克隆，而超过一半的早期复发肝癌的CD8+T细胞与原发肝癌CD8+T细胞源于同一克隆。这一发现揭示了为什么早期复发肝癌细胞不能被具有记忆性的CD+CD8+T细胞识别的原因。
3.早期复发肝癌具有更强的免疫逃逸分子特征。复发肝癌细胞的免疫逃逸信号通路普遍激活，而原发肝癌细胞主要是增殖相关信号通路活化。复发肝癌细胞上调多种免疫逃逸分子的表达，例如CD47、PD-L1、CTLA4等。
早期复发肝癌细胞通过PD-L1阻断DC抗原递呈，实施免疫逃逸。配体受体互作分析表明复发肝癌细胞PD-L1与DC的CD80分子互作相关性最为显著。由于PD-L1与DC表面CD80结合的亲和力高于CD8+T细胞表面CD28分子与DC表面CD80结合的亲和力，即当PD-L1和CD28同时存在时，CD80优先结合PD-L1。这将导致DC对CD8+T细胞的共刺激信号被竞争性抑制，进而阻断了抗原递呈过程，抑制CD8+T细胞的活化。做个形象的比喻，这样一来原本执行教育CD8+T细胞功能的DC被复发肿瘤细胞黑化，导致其无法被有效激活执行杀伤的功能（对于这种细胞间互作，需要展示复杂的细胞间通讯mIHC是一种很好的展示方法）。
小结
近年来，随着免疫检查点抑制剂（如PD-L1、PD-1和CTLA4抗体等）的临床应用，肝癌有效率相对较低。本研究从单细胞水平+多色荧光免疫组化技术系统解析了肝癌原发和复发肿瘤的免疫微生态差异，揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制，为进一步提升肝癌免疫治疗的疗效和寻找有效肝癌复发转移防治新策略提供更多理论依据和实验证据。