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年12月23日，医院樊嘉院士团队在CellPress细胞出版社旗下期刊Cell《细胞》上发表了一篇新研究，题为“Single-celllandscapeoftheecosysteminearly-relapsehepatocellularcarcinoma”，运用单细胞全长转录组测序技术，对肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微生态系统做出了系统性的刻画，在单细胞水平上揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制。
CellPress细胞出版社特别邀请论文通讯作者之一医院院长樊嘉院士接受采访，介绍了该研究工作开展的背景、亮点以及下一步的研究计划。
研究简介
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。我国每年新诊断的肝癌约占全球一半以上，其发病率在我国恶性肿瘤中位居第四位，死亡率第二位。目前，手术是治愈肝癌最主要的手段，但术后5年内复发转移率高达60%~70%。早期肿瘤复发是指手术后两年内出现的复发，占肝癌术后复发的三分之二以上，预后差。探索肝癌术后复发和转移的相关机制，尤其是早期复发，将有助于提升我们对肿瘤发生、发展机制的理解，发现更有效的肝癌治疗策略。
越来越多的研究表明肿瘤的发生发展和复发转移并不是一个孤立事件，而是肿瘤细胞与其周围免疫微环境不断博弈的结果。虽然近两年来已有国内学者从单细胞水平揭示了肝癌原发肿瘤的免疫微环境构成及其特征，但是早期复发的肝癌免疫微生态系统的组成、特征及其相关免疫逃逸机制目前仍属未知。该研究成果运用单细胞全长转录组测序技术，对肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微生态系统做出了系统性的刻画，在单细胞水平上揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制。
本研究主要科学发现可以概括为以下四点：
1.首次揭示肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微生态系统存在显著差异。与肝癌原发肿瘤相比，早期复发肿瘤中浸润更多的树突状细胞（DC）和CD8+T细胞，而起免疫抑制作用的调节性T细胞浸润更少，提示早期复发肝癌的免疫逃逸机制有别于肝癌原发灶。
2.发现早期复发肝癌中的特征性T细胞亚群：CD+CD8+T细胞。早期复发肝癌中浸润的CD8+T细胞特异性表达CD分子，具有固有免疫样、低细胞毒、低克隆扩增和记忆性的表型。早期复发瘤内的CD+CD8+T细胞数增多与术后预后不良显著相关。早期复发肝癌大量浸润的CD+CD8+T细胞处于未激活状态，导致免疫监视失效，是肝癌术后早期复发的重要原因之一。进一步分析早期复发肝癌细胞和CD8+T细胞的克隆起源，我们发现早期复发肝癌细胞来源于原发肝癌的子克隆，而超过一半的早期复发肝癌的CD8+T细胞与原发肝癌CD8+T细胞源于同一克隆。这一发现揭示了为什么早期复发肝癌细胞不能被具有记忆性的CD+CD8+T细胞识别的原因。
3.早期复发肝癌具有更强的免疫逃逸分子特征。复发肝癌细胞的免疫逃逸信号通路普遍激活，而原发肝癌细胞主要是增殖相关信号通路活化。复发肝癌细胞上调多种免疫逃逸分子的表达，例如CD47、PD-L1、CTLA4等。
4.早期复发肝癌细胞通过PD-L1阻断DC抗原递呈，实施免疫逃逸。配体受体互作分析表明复发肝癌细胞PD-L1与DC的CD80分子互作相关性最为显著。由于PD-L1与DC表面CD80结合的亲和力高于CD8+T细胞表面CD28分子与DC表面CD80结合的亲和力，即当PD-L1和CD28同时存在时，CD80优先结合PD-L1。这将导致DC对CD8+T细胞的共刺激信号被竞争性抑制，进而阻断了抗原递呈过程，抑制CD8+T细胞的活化。做个形象的比喻，这样一来原本执行教育CD8+T细胞功能的DC被复发肿瘤细胞黑化，导致其无法被有效激活执行杀伤的功能。
小结
近年来，随着免疫检查点抑制剂（如PD-L1、PD-1和CTLA4抗体等）的临床应用，为肝癌病人带来了福音，但有效率仅有15%~20%。本研究从单细胞水平系统解析了肝癌原发和复发肿瘤的免疫微生态差异，揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制，为进一步提升肝癌免疫治疗的疗效和寻找有效肝癌复发转移防治新策略提供更多理论依据和实验证据。
第一作者：孙云帆、吴靓、钟裕、周恺乾、侯勇
通讯作者：樊嘉、杨欣荣、刘石平
通讯单位：复旦大学、深圳华大
作者专访
CellPress细胞出版社特别邀请樊嘉院士进行了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：您的团队是在怎样的背景下开展此项研究的？在此之前，是否有相关阶段性成果发表？
樊嘉院士：成为一家“临床与科教同行、务实与创新并重”医院，是医院对自己的定位。而做一名“既懂临床、又懂科研”的“研究型医生”医院对每一位医生的要求。我们团队一直秉承着“从临床中来，到临床中去”的理念，从临床工作中面临的实际问题中发现、凝练关键科学问题，所获得的科研成果再通过产业化服务临床并提升临床诊疗水平。
此次研究我们就是抓住了肝癌早期复发这一临床痛点和难点问题，通过与华大基因合作，运用单细胞全长转录组测序技术解析早期复发肝癌的免疫微环境单细胞图谱，协助我们揭示肝癌复发的免疫逃逸机制。这是我们首次与华大基因在单细胞组学方面的合作，未来在这一领域我们会继续深入的合作，后续还会有新的成果不断涌现，为更多的病人造福。
CellPress：能否介绍一下该研究的亮点主要有哪些？
樊嘉院士：本研究最大的亮点在于利用单细胞测序技术刻画了复发性肝癌肿瘤细胞与免疫系统博弈的微观过程。我们首次证实肝癌早期复发瘤与原发瘤的免疫细胞类群分布存在显著差异。在肝癌早期复发瘤内，负责免疫识别的树突状细胞（DC）和负责免疫攻击的CD8+T细胞数量更多，而发挥免疫抑制作用的调节性T细胞数量更少。进一步研究发现与原发瘤内浸润的经典耗竭状态CD8+T细胞不同，早期复发瘤浸润的CD8+T细胞过表达KLRB1（CD）基因，并且表现为固有免疫样、低细胞毒和低克隆扩增状态。早期复发瘤内的CD+CD8+T细胞数增多与术后预后不良显著相关。我们进一步分析了早期复发肝癌的CD8+T细胞和肿瘤细胞的克隆起源，结果提示超过一半的早期复发肝癌CD8+T细胞来自原发瘤，它们有免疫记忆，可以对肿瘤抗原快速进行二次打击，发挥高效的免疫杀伤作用。另一方面早期复发肝癌细胞来源于原发瘤的子克隆，它们的肿瘤新抗原可能被免疫系统忽略，导致具备免疫记忆的CD8+T细胞浸润早期复发瘤内后并不能识别它们，无法实施免疫监视和杀伤，最终放任这些肿瘤细胞生长，形成复发肿瘤。最后，我们聚焦在肿瘤细胞的角度，展示了它们在早期复发肝癌抑制性免疫微环境中的作用及机制。我们发现早期复发肝癌细胞免疫逃逸相关信号通路普遍激活，而原发肝癌细胞增殖相关信号通路活化。复发肝癌细胞上调多种免疫逃逸分子的表达，例如CD47、PD-L1、CTLA4等。早期复发肝癌细胞表达的PD-L1分子，优先与DC细胞结合，导致DC细胞被占位，无法将免疫激活信号传递给还未受过免疫训练的CD8+T细胞，使得新来的CD8+T细胞不能被激活，无法发挥免疫杀伤功能。
CellPress：您认为该研究成果对于设计有效的抗癌疗法，包括免疫疗法，将起到哪些作用？
樊嘉院士：首先，早期复发肝癌可能通过缺失原发癌新抗原逃避CD8+T细胞识别，靶向治疗和放化疗有助于暴露复发肿瘤新抗原，提升免疫治疗效果，这为当下临床运用的免疫治疗联合放化疗或靶向治疗提供了理论依据。此外，我们的研究还发现免疫检查点分子CTLA4和HAVCR2在肝癌浸润CD8+T细胞耗竭过程中的表达上调程度是PD1的5倍左右，提示联合CTLA4和TIM3抑制剂的疗效可能优于PD1抑制剂。
CellPress：能否谈一下您对于当前肝癌免疫治疗的看法，您认为还有存在哪些瓶颈亟待突破？
樊嘉院士：近年来，随着免疫检查点抑制剂（如PD-L1、PD-1和CTLA4抗体等）的临床应用，为肝癌病人带来了福音，但有效率仅有15%~20%。究其原因，传统观点认为，可能与肿瘤中T浸润数量有关，即所谓的“冷肿瘤”。但是我们的研究发现在肝癌早期复发瘤内浸润的CD8+T细胞数量甚至高于原发瘤。如果按照T细胞浸润数量划分的话早期复发肝癌应该属于“热肿瘤”，但是它们的功能状态却是既不激活也不耗竭的状态。这就解释了为什么单纯使用免疫检查点抑制剂的临床疗效有限的原因之一。所以从我们的研究结果不难看出，肝癌在复发或转移过程中的免疫微环境的质和量均存在很大的异质性，如何克服这种异质性也正是未来肝癌免疫治疗所急需突破的瓶颈。
CellPress：下一步，您团队的相关研究将集中在哪些方面？计划取得怎样的成果？
樊嘉院士：首先我们将会继续探索本研究中所发现的早期复发肝癌特征性浸润的CD+CD8+T细胞亚群成为肝癌早期复发防治靶标的可行性。早期复发肝癌浸润的CD+CD8+T细胞具有记忆性T细胞的分子特征，其本身具有快速响应和杀伤功能，但是由于复发肝癌细胞的免疫逃逸，导致它们无法有效被唤醒执行杀伤功能。因此未来有望通过重新激活CD+CD8+T细胞实现肝癌早期复发的有效防治。此外我们还发现复发肝癌细胞较原发肝癌细胞表达更多的CD47分子。CD47与巨噬细胞表面的SIRPα分子结合进而抑制巨噬细胞杀伤癌细胞的能力。这也就解释了为什么复发肝癌细胞能逃避巨噬细胞攻击。因此我们也会积极探索CD47抑制剂在防治肝癌早期复发中的临床价值。最后，我们将依托时空组学技术的创新发展，在肝胆肿瘤数字化病理，免疫微环境时空图谱等方面开展高精度的系统研究。
作者简介
樊嘉院士
樊嘉，医院院长；享受国务院特殊津贴专家、博士生导师、教授、主任医师；上海市肝病研究所所长、上海市肝脏肿瘤临床医学中心主任；复旦大学肝癌研究所所长、复旦中山肿瘤防治中心主任；中国医师协会外科医师分会会长；中国医师协会外科医师分会肝脏外科医师委员会主任委员；CSCO副理事长、中华医学会常务理事、FACS、ASCO、SSO；《原发性肝癌诊疗规范（年版、年版）》编写专家委员会主委。
从事肝肿瘤外科临床诊疗与基础研究三十余年，提出我国肝癌肝移植适应证“上海复旦标准”。以第一作者和通讯作者发表包括：Cell、Nature、LancetOncology、JournalofClinicalOncology、Gastroenterology、Hepatology、Gut等论著余篇。作为第一完成人获教育部自然科学奖一等奖（），国家科技进步二等奖（、）；作为主要参与者曾获3项国家科技进步二等奖和1项国家科技进步一等奖。近年来承担国家科技支撑计划等国家及省部级课题30余项。荣获：谈家桢奖（）、何梁何利科技进步奖（）、吴阶平-保罗杨森医学药学奖（）、中国医师奖（）、全国十佳优秀科技工作者（）、全国十大我最喜爱的健康卫士（）、上海市劳模（）、全国劳模（）、世界杰出华人医师霍英东奖（）等荣誉称号。
相关论文信息
▌论文标题：
Single-celllandscapeoftheecosysteminearly-relapsehepatocellularcarcinoma
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